您好,欢迎光临酶免试剂盒商城!
全国服务热线: 400-7500-220 15189285254
关注我们
当前位置: 首页 > 技术中心 > 细胞凋亡的检测方法

细胞凋亡的检测方法


酶免官方商城 / 2016-07-02

 

 一、形态学观察方法
    1
HE染色、光镜观察:凋亡细胞呈圆形,胞核深染,胞质浓缩,染色质成团块状,细胞表面有“出芽”现象。
    2
、丫啶橙(AO)染色,荧光显微镜观察:活细胞核呈黄绿色荧光,胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧,可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。
    3
、台盼蓝染色:如果细胞膜不完整、破裂,台盼蓝染料进入细胞,细胞变蓝,即为坏死。如果细胞膜完整,细胞不为台盼蓝染色,则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性,区别坏死细胞有一定的帮助。
    4
、透射电镜观察:可见凋亡细胞表面微绒毛消失,核染色质固缩、边集,常呈新月形,核膜皱褶,胞质紧实,细胞器集中,胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。
    
二、DNA凝胶电泳
    
(一)、检测原理
    
细胞发生凋亡或坏死,其细胞DNA均发生断裂,细胞内小分子量DNA片断增加,高分子DNA减少,胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间,出现180200bpDNA片断,而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断,利用此特征可以确定群体细胞的死亡,并可与坏死细胞区别。
    
(二)结果判断
    
正常活细胞DNA电泳出现阶梯状(LADDER)条带;坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带。
    
三、酶联免疫吸附法(ELISA)核小体测定
    
凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成,可由ELISA法检测。
    
(一)检测步骤
    1
、将凋亡细胞裂解后高速离心,其上清液中含有核小体;
    2
、在微定量板上吸附组蛋白体’
    3
、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘
    4
、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’
    4
、加酶的底物,测光吸收制。
    
(二)用途
    
该法敏感性高,可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。
    
四、流式细胞仪定量分析
    
(一)检测原理
    
细胞发生凋亡时,其细胞膜的通透性也增加,但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。
    
(二)应用价值
    
流式细胞仪检测具有以下特点:
    1
)、检测的细胞数量大,因此其反映群体细胞的凋亡状态比较准确
    2
)、可以做许多相关性分析
    3
)、结合被检测细胞的DNA含量的分析,可确定凋亡的细胞所处的细胞周期
    
■检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI双染色法
    
细胞发生凋亡时,其细胞膜的通透性液增加,但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间,利用这一特点,被检测细胞悬液用荧光素染色,利用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。
    
DNA片断原位标记法
    
凋亡细胞DNA片断原位末端检测技术是指在细胞(或组织)结构保持不变的情况下,用荧光素、生物素标记的脱氧尿三磷酸(deoxyuridinetriphateDUTP)和末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)相反应与凋亡细胞裂解后3·的羟基(-OH)端结合,经显色反应后检测DNA裂解点的技术。
    DNA
片段原位标记法有二种:
    1
、原位缺口转移(insitunick-translation,ISNT)技术,它是利用DNA多聚酶I将标记的核苷酸连接到断裂DNA3·-OH
    2
、原位缺口末端标记技术(insituendlabellingtechnique,ISEL),即TUNEL法,它是利用TdT将标记的DUPT接到3·-OH端。研究证明,TUNEL法的敏感性远高于ISNT,尤其对早期凋亡的检测,TUNEL更为合适。
    
■检测细胞膜成分变化的AnnexinV联合PI
    1
、原理:在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸(PS)迁移至细胞膜外测。磷脂结合蛋白VAnnexinV)是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白,它于PS具有高度的结合力。因此,AnnexinV可以作为探针检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝氨酸。故利用对PS有高度亲和力的AnnexinV,将AnnexinV标记上荧光素(如异硫氰酸荧光素FITC),同时结合使用PI拒染法(因坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外测,且对PI高染)进行凋亡细胞双染法后用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。
    2
、结果判断:正常活细胞AnnexinVPI均低染;凋亡细胞AnnexinV高染、PI低染;坏死细胞AnnexinV/PI均高染。
    3
、应用价值:细胞发生凋亡时,膜上的PS外露早于DNA断裂发生,因此AnnexinV联合PI染色法检测早期细胞凋亡较TUNEL法更为灵敏。又AnnexinV联合PI染色不需固定细胞,可避免PI染色因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法因固定出现的DNA片段丢失。


负责区域:全国
酶免客服热线:15189285254
相关问题请咨询售前客服。为避免丢失消息,请尽量添加好友!