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  •  

     一、形态学观察方法
        1
    HE染色、光镜观察:凋亡细胞呈圆形,胞核深染,胞质浓缩,染色质成团块状,细胞表面有“出芽”现象。
        2
    、丫啶橙(AO)染色,荧光显微镜观察:活细胞核呈黄绿色荧光,胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧,可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。
        3
    、台盼蓝染色:如果细胞膜不完整、破裂,台盼蓝染料进入细胞,细胞变蓝,即为坏死。如果细胞膜完整,细胞不为台盼蓝染色,则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性,区别坏死细胞有一定的帮助。
        4
    、透射电镜观察:可见凋亡细胞表面微绒毛消失,核染色质固缩、边集,常呈新月形,核膜皱褶,胞质紧实,细胞器集中,胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。
        
    二、DNA凝胶电泳
        
    (一)、检测原理
        
    细胞发生凋亡或坏死,其细胞DNA均发生断裂,细胞内小分子量DNA片断增加,高分子DNA减少,胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间,出现180200bpDNA片断,而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断,利用此特征可以确定群体细胞的死亡,并可与坏死细胞区别。
        
    (二)结果判断
        
    正常活细胞DNA电泳出现阶梯状(LADDER)条带;坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带。
        
    三、酶联免疫吸附法(ELISA)核小体测定
        
    凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成,可由ELISA法检测。
        
    (一)检测步骤
        1
    、将凋亡细胞裂解后高速离心,其上清液中含有核小体;
        2
    、在微定量板上吸附组蛋白体’
        3
    、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘
        4
    、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’
        4
    、加酶的底物,测光吸收制。
        
    (二)用途
        
    该法敏感性高,可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。
        
    四、流式细胞仪定量分析
        
    (一)检测原理
        
    细胞发生凋亡时,其细胞膜的通透性也增加,但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。
        
    (二)应用价值
        
    流式细胞仪检测具有以下特点:
        1
    )、检测的细胞数量大,因此其反映群体细胞的凋亡状态比较准确
        2
    )、可以做许多相关性分析
        3
    )、结合被检测细胞的DNA含量的分析,可确定凋亡的细胞所处的细胞周期
        
    ■检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI双染色法
        
    细胞发生凋亡时,其细胞膜的通透性液增加,但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间,利用这一特点,被检测细胞悬液用荧光素染色,利用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。
        
    DNA片断原位标记法
        
    凋亡细胞DNA片断原位末端检测技术是指在细胞(或组织)结构保持不变的情况下,用荧光素、生物素标记的脱氧尿三磷酸(deoxyuridinetriphateDUTP)和末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)相反应与凋亡细胞裂解后3·的羟基(-OH)端结合,经显色反应后检测DNA裂解点的技术。
        DNA
    片段原位标记法有二种:
        1
    、原位缺口转移(insitunick-translation,ISNT)技术,它是利用DNA多聚酶I将标记的核苷酸连接到断裂DNA3·-OH
        2
    、原位缺口末端标记技术(insituendlabellingtechnique,ISEL),即TUNEL法,它是利用TdT将标记的DUPT接到3·-OH端。研究证明,TUNEL法的敏感性远高于ISNT,尤其对早期凋亡的检测,TUNEL更为合适。
        
    ■检测细胞膜成分变化的AnnexinV联合PI
        1
    、原理:在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸(PS)迁移至细胞膜外测。磷脂结合蛋白VAnnexinV)是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白,它于PS具有高度的结合力。因此,AnnexinV可以作为探针检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝氨酸。故利用对PS有高度亲和力的AnnexinV,将AnnexinV标记上荧光素(如异硫氰酸荧光素FITC),同时结合使用PI拒染法(因坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外测,且对PI高染)进行凋亡细胞双染法后用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。
        2
    、结果判断:正常活细胞AnnexinVPI均低染;凋亡细胞AnnexinV高染、PI低染;坏死细胞AnnexinV/PI均高染。
        3
    、应用价值:细胞发生凋亡时,膜上的PS外露早于DNA断裂发生,因此AnnexinV联合PI染色法检测早期细胞凋亡较TUNEL法更为灵敏。又AnnexinV联合PI染色不需固定细胞,可避免PI染色因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法因固定出现的DNA片段丢失。

    ...
  •    在ELISA中除了包被外,一般需进行4-5次加样。在定性测定中有时不强调加样量的准确性,例如规定为加样一滴。此时应该使用相同口径的滴管,保持准确的加样姿势,使每滴液体的体积基本相同。在定量测定中则加样量应力求准确。标本和结合物的稀释液应按规定配制。加样时应将液体加在孔底,避免加在孔壁上部,并注意不可出现气泡。

      ELISA中加样须注意如下问题:

      1.吸取样品时,加样枪吸头不应黏附多余的液体;加样时不可90度向孔中滴加液体,这样会导致液体残留在吸头上,加样不准确!

      2.不要将吸头伸入孔中,一方面若接触孔底可能压弯吸头,另一方面可能会将孔中的液体吹起来,加样不准确!

      正确的加样方法应为45度,吸头贴着孔壁加入,应注意:

      1.角度太小,会使液体残留在孔壁上,导致加样不准确!

      2.吸头应当贴着管壁和液面的交界处。

    ...
  •  

    做好对照

        正式试验时,应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件,待检样品应作一式二份,以保证实验结果的准确性。有时本底较高,说明有非特异性反应,可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。

    实验条件的选择

        ELISA中,进行各项实验条件的选择是很重要的,其中包括:

    (1) 固相载体的选择:许多物质可作为固相载体,如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体,在使用前均可进行筛选:用等量抗原包被,在同一实验条件下进行反应,观察其显色反应是否均一性,据此判明其吸附性能是否良好。

    (2) 包被抗体(或抗原)的选择:将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时,要求纯度要好,吸附时一般要求PH9.09.6之间。吸附温度,时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4 1824小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定:即用不同的蛋白质浓度(0.11.010μg/ml)进行包被后,在其它试验条件相同时,观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为110μg/ml

    (3) 酶标记抗体工作浓度的选择:首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定(见酶标记抗体部份)。然后再固定其它条件或采取“方阵法"(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。

    (4) 酶的底物及供氢体的选择:对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应,而本身无色。有些供氢体(OPD)有潜在的致癌作用,应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体,如TMBABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后,应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间,以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制,尤其是H2O2在临用前加入。

     

     

    ...
  • 小鼠ELISA试剂盒有哪些其他保存方法

       小鼠ELISA试剂盒说明:

      1.检测原理:采用双抗体夹心ABC-ELISA法

      2.试剂盒保存:-20℃(较长时间不用时);2-8℃(频繁使用时)。

      3.浓洗涤液低温保存会有盐析出,稀释时可在水浴中加温助溶。

      4.中、英文说明书可能会有不一致之处,请以英文说明书为准。

      5.刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质,此为正常现象,不会对实验结果造成任何影响。

      小鼠ELISA试剂盒的其他保存如下:

      1.ELISA试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用,酶标包被板开封后如未用完,板条应装入密封袋中保存。

      2.浓洗涤液可能会有结晶析出,稀释时可在水浴中加温助溶,洗涤时不影响结果。

      3.各步加样均应使用加样器,并经常校对其准确性,以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。

      4.请每次测定的同时做标准曲线,最好做复孔。如标本中待测物质含量过高(样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值),请先用样品稀释液稀释一定倍数(n倍)后再测定,计算时请最后乘以总稀释倍数(×n×5)。

      5.封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。

      6.底物请避光保存。

  • 小鼠ELISA试剂盒的通过实验来确定

       在小鼠ELISA试剂盒中一般有3次加样步聚,即加标本,加酶结合物,加底物。冻结血清融解后,蛋白质局部浓缩,分布不均,应充分混匀宜轻缓,避免气泡,可上下倒置混和,不要在混匀器上强烈振荡。制备血浆标本需借助于抗凝剂,而血清标本只要待血清天然凝固、血块收缩后即可取得。也可在板孔中加入稀释液,再在其加入血清标本,然后在微型震荡器上震荡1分钟以保证混和。一般说来,在5天内测定的血清标本可放置于4℃,超过一周测定的需低温冰存。血清标本可按常规方法采集,应留意避免溶血,红细胞溶解时会开释出具有过氧化物酶活性的物质,以HRP为标记的小鼠ELISA试剂盒测定中,溶血标本可能会增加非特异性显色。如在冰箱中保留过久,其中的可发生聚合,在间接法ELISA中可使本底加深。本文将叙述板式ELISA各个操纵步骤的留意要点,珠式、管式及磁性球ELSIA,国外试剂均与特殊仪器配合应用,严格遵照划定操纵,必能得出正确的结果。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部,避免加在孔壁上部,并留意不可溅出,不可产气愤泡。有此测定(如间接法ELISA)需用稀的血清,可在试管中按划定的稀释度稀释后再加样。

      1.包被抗原的选择包被抗原可分为天然蛋白、重组蛋白和小分子抗原三大类。天然蛋白需经纯化才能用直接吸附法包被,对于含杂质较多的抗原可以采用间接捕获法包被(先用能够与目的抗原反应的物质如抗体直接吸附在酶标板上,再通过特异性反应使抗原固相化)。经纯化的重组蛋白一般皆可直接包板。小分子抗原比如多肽以及一些小分子有机化合物,由于分子量太小,往往难于直接吸附在酶标板上,一般都先使其与无关蛋白质如BSA等偶联,偶联物吸附于固相载体上。

      2.包被液的选择一般常用的是pH9.6的碳酸盐缓冲液,如果包被的抗原在碱性条件下不稳定的话,也可以使用pH7.2的磷酸盐缓冲液。

      3.包被温度的选择通常是4-8度条件下过夜或者37度保温2小时,我们强烈建议4-8度条件下包被,有利于蛋白活性的保持。

      4.包被浓度的选择包被的最适浓度随固相载体和包被物的性质变化,一般蛋白质的包被浓度为1-5ug/ml,要明确针对特定包被抗原的最适包被浓度需要。包板后需要封闭吗?应该选择什么样的封闭体系?封闭是否必要,取决于ELISA的模式及具体的实验条件。一般说来,双抗体夹心法,只要酶标记物是高活性的,操作时洗涤彻底,不经封闭也可得到满意的结果。而在间接法测定中,封闭一般是必不可少的。常用的封闭剂有0.05%-0.5%的BSA、小鼠ELISA试剂盒10%的小牛血清、1%明胶、5%的脱脂奶粉,AbMART推荐使用5%脱脂奶粉,价廉而且封闭能力强,不过5%脱脂奶粉只适合短期内使用,不宜长期保存,所以ELISA试剂盒中较少使用。

  • 小鼠ELISA试剂盒的双抗体夹心法

       小鼠ELISA试剂盒是以免疫学反应为基础,将抗原、牽9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行,每加入一种试剂孵育后,可通过洗涤除去多余的游离反应物,从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中,通过不同的设计,具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA试剂盒间接法。

      方法一 用于检测未知抗原:

      1. 包被:用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1~10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml,4℃过夜。次日,弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗3次,每次3分钟。(简称洗涤,下同)。

      2. 加样:加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔,阴性对照孔及阳性对照孔)。

      3. 加酶标抗体:于各反应孔中,加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5~1小时,洗涤。

      4. 加底物液显色:于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml,小鼠ELISA试剂盒37℃10~30分钟。

      5. 终止反应:于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

      6. 结果判定:可于白色背景上,直接用肉眼观察结果:反应孔内颜色越深,阳性程度越强,阴性反应为无色或极浅,依据所呈颜色的深浅,以“+”、“-”号表示。也可测O·D值:在ELISA检测仪上,于450nm(若以ABTS显色,则410nm)处,小鼠ELISA试剂盒以空白对照孔调零后测各孔O·D值,若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍,即为阳性。

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  酶免是中国著名ELISA试剂盒王国。随着全球化、国际化战略的推进,酶免已拥有超过5个主要生产基地,分布于全国多个省份及国外,形成了覆盖全球的生产基地和销售网络,能够及时、高效地为顾客提供产品和服务。

  酶免建有规模先进的研究院,拥有科研人员100多名,设有博士后科研工作站、国家认可试验站。目前,酶免拥有10000多种产品,是国内生物领域产品体系较齐全的生产商。酶免提供的上万种ELISA试剂盒,可应用于各个研究领域。

  长久以来,酶免以优质的产品、完善的网络支持功能和强大的技术支持团队得到了国内外客户的认可和赞誉。酶免不仅可以提供全面人性化的在线电子目录,而且还提供用户使用这些试剂盒的心得体会。成千上万的科研者把酶免作为自己的首选,酶免就是要提供充分的信息支持,免费的技术帮助和快速的物流配送。

  酶免以顾客为导向,为了更好地服务顾客,我们聆听客户的需求,根据具体情况制定服务。酶免一直保持在技术发展的前沿,致力于提供及时优质生命科学产品和服务。酶免的目标是向世界各地的研究人员提供高品质,物美价廉的产品。

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