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  •  

     一、形态学观察方法
        1
    HE染色、光镜观察:凋亡细胞呈圆形,胞核深染,胞质浓缩,染色质成团块状,细胞表面有“出芽”现象。
        2
    、丫啶橙(AO)染色,荧光显微镜观察:活细胞核呈黄绿色荧光,胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧,可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。
        3
    、台盼蓝染色:如果细胞膜不完整、破裂,台盼蓝染料进入细胞,细胞变蓝,即为坏死。如果细胞膜完整,细胞不为台盼蓝染色,则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性,区别坏死细胞有一定的帮助。
        4
    、透射电镜观察:可见凋亡细胞表面微绒毛消失,核染色质固缩、边集,常呈新月形,核膜皱褶,胞质紧实,细胞器集中,胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。
        
    二、DNA凝胶电泳
        
    (一)、检测原理
        
    细胞发生凋亡或坏死,其细胞DNA均发生断裂,细胞内小分子量DNA片断增加,高分子DNA减少,胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间,出现180200bpDNA片断,而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断,利用此特征可以确定群体细胞的死亡,并可与坏死细胞区别。
        
    (二)结果判断
        
    正常活细胞DNA电泳出现阶梯状(LADDER)条带;坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带。
        
    三、酶联免疫吸附法(ELISA)核小体测定
        
    凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成,可由ELISA法检测。
        
    (一)检测步骤
        1
    、将凋亡细胞裂解后高速离心,其上清液中含有核小体;
        2
    、在微定量板上吸附组蛋白体’
        3
    、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘
        4
    、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’
        4
    、加酶的底物,测光吸收制。
        
    (二)用途
        
    该法敏感性高,可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。
        
    四、流式细胞仪定量分析
        
    (一)检测原理
        
    细胞发生凋亡时,其细胞膜的通透性也增加,但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。
        
    (二)应用价值
        
    流式细胞仪检测具有以下特点:
        1
    )、检测的细胞数量大,因此其反映群体细胞的凋亡状态比较准确
        2
    )、可以做许多相关性分析
        3
    )、结合被检测细胞的DNA含量的分析,可确定凋亡的细胞所处的细胞周期
        
    ■检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI双染色法
        
    细胞发生凋亡时,其细胞膜的通透性液增加,但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间,利用这一特点,被检测细胞悬液用荧光素染色,利用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。
        
    DNA片断原位标记法
        
    凋亡细胞DNA片断原位末端检测技术是指在细胞(或组织)结构保持不变的情况下,用荧光素、生物素标记的脱氧尿三磷酸(deoxyuridinetriphateDUTP)和末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)相反应与凋亡细胞裂解后3·的羟基(-OH)端结合,经显色反应后检测DNA裂解点的技术。
        DNA
    片段原位标记法有二种:
        1
    、原位缺口转移(insitunick-translation,ISNT)技术,它是利用DNA多聚酶I将标记的核苷酸连接到断裂DNA3·-OH
        2
    、原位缺口末端标记技术(insituendlabellingtechnique,ISEL),即TUNEL法,它是利用TdT将标记的DUPT接到3·-OH端。研究证明,TUNEL法的敏感性远高于ISNT,尤其对早期凋亡的检测,TUNEL更为合适。
        
    ■检测细胞膜成分变化的AnnexinV联合PI
        1
    、原理:在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸(PS)迁移至细胞膜外测。磷脂结合蛋白VAnnexinV)是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白,它于PS具有高度的结合力。因此,AnnexinV可以作为探针检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝氨酸。故利用对PS有高度亲和力的AnnexinV,将AnnexinV标记上荧光素(如异硫氰酸荧光素FITC),同时结合使用PI拒染法(因坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外测,且对PI高染)进行凋亡细胞双染法后用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。
        2
    、结果判断:正常活细胞AnnexinVPI均低染;凋亡细胞AnnexinV高染、PI低染;坏死细胞AnnexinV/PI均高染。
        3
    、应用价值:细胞发生凋亡时,膜上的PS外露早于DNA断裂发生,因此AnnexinV联合PI染色法检测早期细胞凋亡较TUNEL法更为灵敏。又AnnexinV联合PI染色不需固定细胞,可避免PI染色因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法因固定出现的DNA片段丢失。

    ...
  •    在ELISA中除了包被外,一般需进行4-5次加样。在定性测定中有时不强调加样量的准确性,例如规定为加样一滴。此时应该使用相同口径的滴管,保持准确的加样姿势,使每滴液体的体积基本相同。在定量测定中则加样量应力求准确。标本和结合物的稀释液应按规定配制。加样时应将液体加在孔底,避免加在孔壁上部,并注意不可出现气泡。

      ELISA中加样须注意如下问题:

      1.吸取样品时,加样枪吸头不应黏附多余的液体;加样时不可90度向孔中滴加液体,这样会导致液体残留在吸头上,加样不准确!

      2.不要将吸头伸入孔中,一方面若接触孔底可能压弯吸头,另一方面可能会将孔中的液体吹起来,加样不准确!

      正确的加样方法应为45度,吸头贴着孔壁加入,应注意:

      1.角度太小,会使液体残留在孔壁上,导致加样不准确!

      2.吸头应当贴着管壁和液面的交界处。

    ...
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    做好对照

        正式试验时,应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件,待检样品应作一式二份,以保证实验结果的准确性。有时本底较高,说明有非特异性反应,可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。

    实验条件的选择

        ELISA中,进行各项实验条件的选择是很重要的,其中包括:

    (1) 固相载体的选择:许多物质可作为固相载体,如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体,在使用前均可进行筛选:用等量抗原包被,在同一实验条件下进行反应,观察其显色反应是否均一性,据此判明其吸附性能是否良好。

    (2) 包被抗体(或抗原)的选择:将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时,要求纯度要好,吸附时一般要求PH9.09.6之间。吸附温度,时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4 1824小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定:即用不同的蛋白质浓度(0.11.010μg/ml)进行包被后,在其它试验条件相同时,观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为110μg/ml

    (3) 酶标记抗体工作浓度的选择:首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定(见酶标记抗体部份)。然后再固定其它条件或采取“方阵法"(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。

    (4) 酶的底物及供氢体的选择:对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应,而本身无色。有些供氢体(OPD)有潜在的致癌作用,应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体,如TMBABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后,应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间,以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制,尤其是H2O2在临用前加入。

     

     

    ...
  • 如何保证ELISA试剂盒的产品质量和使用质量

    对于实验室科研工作者来说,产品的质量是广大实验者非常关注的一个重要问题,这是影响实验结果的一大因素。产品质量来源于生产厂家,实验的质量就是与实验操作者有很大的关系了,那么如何保证ELISA试剂盒的产品质量与使用质量。
        ELISA
    试剂盒诊断试剂经历了从合成肽向基因工程抗原的过渡。由于历史的原因,人们往往以反应本底的好坏来衡量ELISA反应试剂盒,酶免ELISA试剂盒,其产品质量优势表现在:
    1.
    洁净的生产环境及科学的生产操控规程,保证了每个品种不同批次产品质量的稳定性。
    2.
    原料:我公司采用国际最著名的试剂盒生产商的抗体作为原料。我们的其它辅料除一些盐外,其余生物活性原料均为原装进口。
       
    与国内其它生产商相比,检测抗体和HRP酶我公司产品中提供直接的稀释液,直接加样,免去了客户自己从高浓度向低浓度稀释;底物部分,我公司ELISA试剂盒产品中配置进口单组分TMB,免去客户用双组分时用前的混合步骤。
       
    我公司提供的ELISA试剂盒样本稀释液可有效消除血清中某些成份的影响,准确度更高。并且采用国内精度最好的包被机,板内误差和板间误差在5%之内。

    酶免ELISA提醒您:保证实验质量,您需注意的事项有:
    1.
    合理安排检测量,以免反应板过多造成洗板等待时间长。
    2.
    显色剂尽量在临用前配制,坚持不用过期显色剂,肉眼可见浅蓝色的TMB显色剂不用。
    3.
    加样时保持显色剂不外流;AB液应避免接触金属器械。加终止液时应避免产生气泡。
    4.
    加酶ELISA试剂盒后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。

     


    酶免ELISA试剂盒欢迎您的来电!

  • 显色和比色在ELISA试剂盒实验中的影响

    ELISA试剂盒有着准确性高、灵敏度高、特异性强等很多的优点,它在检测抗体、抗原等方面有很好的应用,深受广大用户朋友的喜爱。然而,在实验过程中,也需要注意很多问题,特别是显色、比色问题。

    ELISA知识要点显色和比色分析 

    显色 

        显色是ELISA中的最后一步温育反应,此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内,阴性孔可保持无色,而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。在定量测定中,加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确。定性测定的显色可在室温进行,时间一般不需要严格控制,有时可根据阳性对照孔和阴性对照孔的显色情况适当缩短或延长反应时间,及时判断。

        OPD(邻苯二胺)底物显色一般在室外温或37℃反应20-30分钟后即不再加深,再延长反应时间,可使本底值增高。OPD底物液受光照会自行变色,显色反应应避光进行,ELISA试剂盒显色反应结束时加入终止液终止反应。OPD产物用硫酸终止后,显色由橙黄色转向棕黄色。

        TMB(四甲基联苯胺)受光照的影响不大,可在室温中置于操作台上,边反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性,宜在规定的适当时间阅读结果。TMBHRP作用后,约40分钟显色达顶峰,随即逐渐减弱,至2小时后即可完全消退至无色。TMB的终止液有多种,叠氮钠和十二烷基硫酸钠(SDS)等酶抑制剂均可使反应终止。这类终止剂尚能使蓝色维持较长时间(12-24小时)不褪,是目视判断的良好终止剂。此外,各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色,此时可用特定的波长(450nm)测读吸光值。

    比色 

        比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体,然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中。以软板为载体的试验,需先将板置于标准96孔的座架中,才可进行比色。最好在加底物液显色前,先将软板边缘剪净,这样,此板就可完全平妥坐入座架中。

        比色时应先以蒸馏水校零点,测读底物孔(未经任何反应仅加底物液的孔)和空白孔(以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔),以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点,以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度,然后进行计算。

        比色结果的表达以往通用光密度(oplical densityOD),现按规定用吸光度(absorbenceA),两者含义相同。通常的表示方法是,将吸收波长写于A字母的右下角,如OPD的吸收波长为492nm,表示方法为“A492nm"“OD492nm"

    酶标比色仪

        酶标比色仪简称酶标仪,通常指专用于测读ELISA结果吸光度的光度计。针对固相载体形式的不同,各有特制的适用于板、珠和小试管的设计。许多试剂公司配套供应酶标仪。酶标仪的主要性能指标有:测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般可精确到0.001,准确性为±1%,重复性达0.5%。举例说,若某孔测得的A值为1.083,则该孔相对于空气的真实A值应为1.083± 0.01(1.0731.093),重复测定数次,其A值均应1.083±0.051.0781.088)在之间。酶标仪的可测范围视各酶标仪的性能而不同。普通的酶标仪在0.0002.000,新型号的酶标仪上限拓宽达2.900,甚至更高。超出可测上限的A值常以“*"“over"或其它符号表示。应注意可测范围与线性范围的不同,线性范围常小于可测范围,比如某一酶标仪的可测范围为0.0002.900,而其线性范围仅0.0002.000,这在定量ELISA中制作标准曲线时应予注意。

        酶标仪不应安置在阳光或强光照射下,操作时室温宜在15-30℃,使用前先预热仪器15-30分钟,测读结果更稳定。

        测读A值时,要选用产物的敏感吸收峰,如OPD492nm波长。ELISA试剂盒有的酶标仪可用双波长式测读,即每孔先后测读两次,第一次在最适波长(W1),第二次在不敏感波长(W2),两次测定间不移动ELISA板的位置。例如OPD492nmW1630nmW2,最终测得的A值为两者之差(W1-W2)。双波长式测读可减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。


    酶免ELISA试剂盒

     

     

  • PeproTech细胞因子溶解/储存和分装方法

        PeproTech细胞因子中不含载体蛋白(Carrier Protein)或其他添加剂(如BSA、HAS或蔗糖等),并且通常以最少量的盐来进行冻干处理,因此微量的细胞因子在冻干过程中会沉积于管内,形成很薄或不可见的蛋白层。所以我们建议在收到产品后,务必在开盖前先离心,使粘在管盖或管壁上的蛋白聚集于管底(此时能否见到白色沉淀均属正常现象)。 

    1.离心:高速离心 10, 000 rpm 20-30 秒,或低速离心 2, 000 rpm 5 分钟。 

    2.溶解(Reconstitution):用去离子水或其它缓冲液(根据说明书要求进行选择)溶解至说明书要求的浓度 (一般为 0.1-1.0 mg/mL,如10ug的产品,需用10uL-100uL的去离子水或缓冲液溶解)。溶解时不可振荡,避免因化学键的断裂造成蛋白失活,可加入适当的溶剂轻摇并静置一段时间,待细胞因子完全溶解后使用。溶剂的选择: 

    1)要求用去离子水溶解的产品,务必不可用盐溶液,避免过高的盐浓度造成蛋白不可逆的析出; 

    2) 要求用盐溶液溶解的产品,请依照说明书上的浓度,同样也是为了避免过高的盐浓度。 

    3.分装和贮存(Aliquot and Storage):蛋白溶解后可根据自己的实验需要进一步稀释成工作液,稀释可用RPMI 1640DMEMPBS等溶液,其中最好含有5-10%FCS (小牛血清或胎牛血清)或0.5 %BSA(牛血清白蛋白)来稳定蛋白。工作液在4℃可保存1周,如需长期保存,则需分装冻存于-20 (注意:不可冻存于-80℃)。分装时每管中工作液的体积最好是一次实验的用量,以实现每次实验用完一只工作液,避免反复冻融引起蛋白活性的降低。

     

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公司简介

  酶免是中国著名ELISA试剂盒王国。随着全球化、国际化战略的推进,酶免已拥有超过5个主要生产基地,分布于全国多个省份及国外,形成了覆盖全球的生产基地和销售网络,能够及时、高效地为顾客提供产品和服务。

  酶免建有规模先进的研究院,拥有科研人员40多名,设有博士后科研工作站、国家认可试验站。目前,酶免拥有10000多种产品,是国内生物领域产品体系较齐全的生产商。酶免提供的上万种ELISA试剂盒,可应用于各个研究领域。

  长久以来,酶免以优质的产品、完善的网络支持功能和强大的技术支持团队得到了国内外客户的认可和赞誉。酶免不仅可以提供全面人性化的在线电子目录,而且还提供用户使用这些试剂盒的心得体会。成千上万的科研者把酶免作为自己的首选,酶免就是要提供充分的信息支持,免费的技术帮助和快速的物流配送。

  酶免以顾客为导向,为了更好地服务顾客,我们聆听客户的需求,根据具体情况制定服务。酶免一直保持在技术发展的前沿,致力于提供及时优质生命科学产品和服务。酶免的目标是向世界各地的研究人员提供高品质,物美价廉的产品。

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