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ELISA样本收集处理方法


酶免官方商城 / 2018-11-14

    

    可用于ELISA实验的样本一般有血清、血浆、尿液、裂解液、唾液、粪便、脑脊液、细胞培养上清以及组织匀浆等。不同样本类型的预处理方法也不同。适当的样本预处理是确保ELISA实验正确性和准确性的第一步。这里,我们将介绍几种不同样本类型的处理方法。


    1.血清
    血清是ELISA实验常用的样本,其预处理也十分简单。
    使用无热原无内毒素的试管或离心管采集血液样本,将试管或离心管在室温下放置2小时或4℃过夜,分离出血清(建议倾斜试管或离心管以扩大液面的横截面,使血清可以更大程度地分离出来)。4℃下以1000×g离心20分钟,小心收集上清液(血清),立即进行测定。建议在-20℃或-80℃下将收集的血清分装保存,避免反复冻融。

    在收集血液样本的过程中应避免溶血,因为红细胞在溶解时会释放具有过氧化物酶活性的物质,这种情况下,ELISA实验中将会出现非特异性显色反应,导致检测结果不准确,出现假阳性结果。另外,样本还应避免细菌污染,因为细菌可能含有内源性HRP,也会导致检测结果不准确。


    2.血浆

    使用含抗凝剂的采血管或离心管采集血液样本,采集后30分钟内,4℃下以1000×g离心15分钟,小心收集上清液(血浆)。建议在-20℃或-80℃下将收集的血浆分装保存,避免反复冻融。样本应避免溶血或高血脂。常见的抗凝剂包括EDTA,肝素钠,枸橼酸钠等。检测前请仔细阅读ELISA试剂盒说明书,查看该试剂盒针对抗凝剂是否有特殊要求。


    3.细胞培养上清

    将细胞培养上清液吸入离心管中并以1000×g离心20分钟,除去细胞碎片和杂质,收集上清液备用,样本保存在-20℃或-80℃,避免反复冻融。


    4.细胞
    反复冻融方法:
    (1)吸出培养板中的培养基,用胰蛋白酶消化细胞,然后加入适量的培养基将培养板上的细胞冲洗干净。悬浮细胞可以省略该步骤。
    (2)将细胞悬浮液收集到离心管中,以1000×g离心10分钟,然后吸去培养基,用预冷PBS洗涤细胞3次。
    (3)加入适量的预冷PBS(建议在使用前立即加入蛋白酶抑制剂)重悬细胞。在6孔培养板中,每个孔需要150-250μL的PBS来重悬细胞。
    (4)使样本在-20℃或-80℃条件和室温条件下反复冻融,重复冻融过程数次,直至细胞完全裂解。也可以使用超声波细胞破碎器超声处理悬浮液来裂解细胞。
    (5)4℃下以10,000×g离心10分钟,去除细胞碎片,收集上清液, -20℃或-80℃保存,避免反复冻融。

    5.组织匀浆
    (1)用预冷的PBS(0.01M,PH7.4)冲洗组织以除去表面残留的血液或杂质。
    (2)将组织块称重,然后切成尽可能小的碎块,以便充分匀浆。
    (3)加入适量的预冷PBS(体积取决于组织的重量,9 mL PBS适用于1 g组织,建议使用前立即在PBS中加入适量蛋白酶抑制剂),用玻璃匀浆器在冰上或冰浴中充分匀浆。

    (4)将匀浆液吸入离心管中,4℃ 下以5000×g离心5~10分钟,收集上清液,保存至-20℃或-80℃,避免反复冻融。


    6.尿液、唾液及其他生物体液

    以1000×g离心20分钟,收集上清液,立即进行测定。


    一般来说,由于ELISA实验只能检测可溶性蛋白质的含量,因此要求样本应清晰透明并离心除去沉淀物或悬浮物质。为确保实验的准确性, -20℃或-80℃保存的样本应在1-6个月内完成检测,4℃保存的样本在一周内完成检测。此外,样本中不能含有会抑制HRP活性的NaN3,否则会造成假阴性结果。


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